Стратегия генетического картирования и его роль в идентификации новых генов наследственных заболеваний. Картирование хромосом Основные подходы к картированию генома человека

1.1. При цитологическом картировании изучение дифференциально окрашенных хромосом позволяет обнаружить крупные хромосомные перестройки путем сравнения исследуемого образца с контрольным.

1.1.1. Гибридизация in situ: ISH- и FISH- гибридизация

Прямым методом картирования генов на хромосоме является метод гибридизации нуклеиновых кислот. Вариации метода (гибридизация in situ - на месте) и FISH используются в тех случаях, когда имеются пробы, или зон­ды с известными (секвенированными) нуклеотидными последовательно­стями. Зонды - это искусственно синтезированные меченые: радиоактив­ными изотопами или флуоресцентными краси­телями - химически небольшие (10-30 нуклеогидов) сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК), комплементарные ис­комому гену. Эти короткие олигонуклеотиды соединяются только с тем участком ДНК, который содержит последовательность нуклеотидов, стро­го соответствующую (комплементарную) последовательности нуклеотидов зонда. Следовательно, наличие связавшейся с ДНК метки с высокой точ­ностью свидетельствует о присутствии в анализируемом образце искомых последовательностей нуклеотидов.

Локусы генов, комплементарные зондам, могут быть картированы непосредственно на хромосоме путем регистрации радиоактивной метки.

1.1.2. Хромосомный пейнтинг

Одним из наиболее разрешающих методов является многоцветная флуоресцентная гибридизация или хромосомный пейнтинг (хромосомная живопись). Для получения многоцветных изображений используют различные флуорохромы, которыми метят разные зонды ДНК. Информация об интенсивно­сти свечения каждого флуорохрома записывается на компьютере отдельно и каждому из таких изображений присваивается свой собственный псевдо­цвет.

1.1.3. Гибридизация соматических клеток

При цитологическом картировании используется также гибридизация соматических теток. В условиях культуры можно получить соматиче­ские гибриды клеток человека и различных грызунов: человек - мышь, че­ловек - крыса, человек - хомяк. Так, к 2002 году был полностью изучен геном мыши. Оказалось, что многие гены в геноме мыши гомологичны по структуре ге­нам человека.

1.2. Генетическое картирование

Генетические карты - это карты-схемы взаимного расположения генов на индивидуальных хромосомах, т.е. находящихся в одной группе сцепления.

Принципы генетического картирования были впервые разработаны Т. Морганом. Им же была составлена первая генетическая карта X-хромосомы дрозофилы, основанная на учете частоты образования кроссоверных и некроссоверных гамет у самок, гетерозиготных по рецессивным мутациям, локализованным в Х-хромосоме. Так. в мейозе гетерозиготных самок кроссинговер между генами у (желтое тело) и w- (белые глаза) про­исходил в 1,5% случаев, между генами w и m (миниатюрные крылья) -34,5%, а между генами у и т - 36% случаев.

Генетические карты сцепления правильно отражают порядок распо­ложения генов (или генетических маркеров) на хромосомах, однако рас­стояния между ними имеют относительные значения, т.е. не соответствуют реальным физическим расстояниям.

1.3 . Молекулярные маркеры ДНК и их использование для генетического картирования

1.3.1. ПДРФ - маркеры ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК,

Было установлено, что генетическим маркером может быть любое место в геноме, где произошло изменение в последовательности ДНК, которое обнаруживается как внут­реннее различие между индивидами в популяции, но никаких внешних (фенотипических; различий между ними при этом не наблюдается.

У бактерий установлен и выделен целый ряд ферментов рестриктаз, которые узнают специфические последовательности в молекуле ДНК (обычно составляющие 4-6 нуклеотидов) и разрезают двойную спираль внутри или вблизи сайта узнавания, в результате чего образуются рестрикционные фрагменты, или рестрикты.

Отсутствие сайта узнавания может быть связано с делецией. инсер-цией или заменой нуклеотидов. Следовательно, любая мутация, изменяю­щая последовательность нуклеотидов сайта рестрикции, уничтожает этот сайт.

1.3.2. Молекулярные маркеры, основанные на полимера гной цепной реакции (ПЦР-маркеры)

Принципы метода ПЦР. Полимеразная цепная реакция имитирует при­родный процесс воспроизведения (удвоения) ДНК - репликацию, проис­ходящую на матричной основе (по принципу комплементарности) с уча­стием фермента ДНК-полимеразы. Но если во время репликации удваива­ется вся ДНК, то при ПЦР - происходит многократное копирование (вос­произведение, амплификация) лишь интересующего исследователя специфического, небольшого фрагмента, расположенного между двумя праймерами.

1.3.3. Микросателлиты и минисателлиты как молекулярные маркеры

Разновидностями сатДНК являются.микросателлиты (МКС, или про­стые повторяющиеся последовательности - ППП) и минисателлиты (МНС). Минимальная повторяющаяся единица (КОР) микросателлитов включает от 1 до 10 пар нуклеотидов, минисателлитов - 15 -70 пн. Их рас­положение в геноме и число повторений коровых единиц специфичны для каждого организма.

1.4. Физическое картирование

Физическое картиро­вание основано на прямом анализе молекул ДНК. составляющих каждую хромосому (без анализа результатов скрещивания). Его конечная цель -определение последовательности нуклеотидов в каждой хромосоме

1.4.1. Создание рестрикционных карт

Рестрикционное картирование основано на установлении точек действия различных рестриктаз. Распределение сайтов рестрикции пред­ставляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и мо­жет использоваться для его идентификации.

Банк генов. Для этого фрагменты ДНК организма присоединяют к векторным молекулам, т.е. молекулам-переносчикам чужеродных генов. В качестве векторов используют плазмиды бактерий, фаги (вирусы, инфицирующие бактерии), космиды (гибридные молекулы, полученные из ДНК фага К и бактериальной плазмиды; благодаря наличию cos-участка фага А., который обеспечивает замыкание его линейной ДНК в кольцо, космидная ДНК, включившая чужеродные гены, может быть упакована в головку бакте­риофага). В качестве векторов используют также искусственные хромосо­мы дрожжей YAK - (ЯК) и бактерий ВАС - (БАК) хромосомы.

1.4.2. Создание упорядоченных библиотек клонов. Карты контиг.
Процедура "Прогулка по хромосоме"

Чтобы установить порядок расположения клонов (т.е. клонирован­ных фрагментов ДНК) на хромосоме (по ее длине), необходимо выявить участки их частичного перекрывания. Это можно сделать путем гибриди­зации нуклеиновых кислот, если известна нуклеотидная последователь­ность хотя бы одного фрагмента. Его метят радиоактивно или флуорохромом и используют в качестве зонда для создания упорядоченных библио­тек клонов.

"Прогулка по хромосоме" (скользящее зондирование). Для упоря­дочивания клонов используют две разные библиотеки геномной ДНК, по­лученные из ДНК одного и того же организма, но разделенные двумя раз­ными рестриктазами. Если один из генов (или клонов) в первой библиоте­ке удалось картировать и клонировать (т.е. получить из него ДНК-маркирующий сайт - STS), он затем может быть использован в качестве зонда для выявления перекрывающегося клона во второй библиотеке. А изученный клон второй библиотеки может использоваться как зонд для другого перекрывающегося фрагмента первой библиотеки и т.д.

Таким образом устанавливается порядок расположения клонов на хромосоме.

1.4. Определение нуклеотидной последовательности генома (секвенирование ) Исчерпывающая физическая карта генома человека (и любого друго­го организма) должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом.

1.5. Кандидатное картирование

В рамках этих подходов картировать ген означало пройти путь от его функции к локализации на хромосоме (позиции).

Генетическое картирование. Методы картирования генов. Севостьянова Наталия Владимировна доктор медицинских наук, Профессор кафедры биологии и генетики

Слайд 2

План лекции Картирование генов. Хромосомные карты. Цитологические карты. Методы картирования генов. Тестирование мутаций на аллелизм. Хромосомные мутации.

Слайд 3

Генетическое картирование - это определение положения картируемого гена относительно других генов данной хромосомы. Чем больше генов известно у данного вида, тем точнее результаты.

Слайд 4

Генетическая карта хромосомы это схема взаимного расположения генов, находящихся в одной группе сцепления. Как известно, у D. melanogaster в диплоидном наборе четыре пары хромосом.

Слайд 5

Составить такую карту можно только для объектов, у которых изучено большое число мутантных генов Например, у дрозофилы идентифицировано свыше 500 генов, локализованных в 4 группах сцепления. I группа - половые хромосомы (XX - самки, XY - самцы), II, III, IV - аутосомы.

Слайд 6

У кукурузы - свыше 400 генов, распределенных в 10 группах сцепления

Слайд 7

Для составления генетических карт хромосом необходимо выявление множество мутантных генов и проведения многочисленных скрещиваний.

Слайд 8

Генетические карты хромосом составляют для каждой пары гомологичных хромосом. Группы сцепления нумеруют последовательно, по мере их обнаружения. Также указывают полные или сокращённые названия мутантных генов, их расстояния в морганидах. Обозначают место центромеры.

Слайд 9

У менее изученных объектов число обнаруженных групп сцепления меньше гаплоидного числа хромосом. У бактерий, которые являются гаплоидными организмами, имеется одна, чаще всего непрерывная, кольцевая хромосома и все гены образуют одну группу сцепления. Генетическая карта хромосомы кишечной палочки.

10

Слайд 10

Методы картирования генов Физические определение с помощью рестрикционных карт электронной микроскопии вариантов электрофореза межгенных расстояний – в нуклеотидах Генетические определение частот рекомбинаций между генами, в частности, в семейном анализе и др. Цитогенетические гибридизации in situ получение монохромосомных клеточных гибридов делеционный метод и др.

11

Слайд 11

Тестирование мутаций на аллелизм Функциональный тест на аллелизм, который позволяет определить, принадлежат ли мутантные аллели одному локусу или разным. Получают гибридов (гетерокарионов), у которых две исследуемые мутации находятся на разных гомологичных хромосомах - Транс-положение.

12

Слайд 12

Если обе мутации действуют на разные независимые функции (затрагивают два разных гена), то такой гибрид имеет дикий фенотип, так как образуется дигетерозигота, в которой нормальные аллели доминируют над мутантными. Если исследуемые мутации действуют на одну и ту же функцию (повреждают один и тот же ген), то гибрид должен иметь мутантный фенотип.

13

Слайд 13

Цис-тест - получают гибридов, у которых обе исследуемые мутации привнесены одним из родителей, тогда как в хромосомах других содержатся нормальные аллели. Гибриды с цис-положением мутаций должны иметь фенотип дикого типа независимо от того, относятся ли исследуемые мутации к одному или разным генам. Это причина редкого использования цис-теста.

14

Слайд 14

Для построения генетической карты хромосомы эукариот используют мейотический и митотический кроссинговер. Сравнение генетических карт хромосом, построенных разными методами у одного и того же вида, выявляет одинаковый порядок расположение генов, хотя расстояние между конкретными генами на мейотических и митотических генетических картах хромосом могут различаться. Некоторые из таких ошибок можно наблюдать, используя цитогенетические методы

15

Слайд 15

Мейотический кроссинговер - это сложный процесс, в ходе которого возможны ошибки. Кроссоверный обмен осуществляется по типу разрыв-воссоединение. Цитологической иллюстрацией этого механизма может служить мейотический кроссинговер между разноокрашенными сестринскими хроматидами. Иногда воссоединение хроматид происходит неправильно, и это может приводить к образованию дицентрических хромосом и ацентрических фрагментов.

16

Слайд 16

В норме генетические карты хромосом у эукариот линейные. При построении генетических карт хромосом у гетерозигот по транслокации получается генетическая карта хромосом в виде креста. Это указывает на то, что форма карт отражает характер конъюгации хромосом.

17

Слайд 17

Кроссоверные обмены с ошибками воссоединения хроматид называются U-обменами. U-обмены обнаружены у многих видов растений и животных. Наиболее подробно они изучены у ржи (Jones, Brumpton,1971). Частота U-конфигураций у ржи может достигать 30-40% на клетку, или 4-5% на бивалент. Частота несестринских U-обменов значительно выше, чем сестринских. Неправильное воссоединение хроматид может быть одним из факторов, приводящих к образованию несбалансированных гамет.

18

Слайд 18

Цитологическая карта составляется на основании изучения политенных хромосом, что позволяет сопоставить структуру синтезируемого белка с определенным участком хромосомы (геном), так как транскрибируемый участок определяется под микроскопом в виде пуфа. Это позволяет определить локализацию гена.

19

Слайд 19

Цитологическая карта хромосомы представляет собой фотографию или точный рисунок хромосомы, на котором отмечается последовательность расположения генов. Ее строят на основе сопоставления результатов анализирующего скрещивания и хромосомных перестроек. Например, если хромосома с доминантными генами будет последовательно терять отдельные локусы (при воздействии на нее мутагенов), то в гетерозиготе начнут проявляться рецессивные признаки. Порядок проявления признаков будет указывать на последовательность расположения генов.

20

Слайд 20

Метод цитологических карт основан на использовании хромосомных перестроек. При облучении и действии мутагенов в хромосомах часто наблюдаются потери (делеции) или вставки (дупликации) небольших фрагментов, сравнимых по величине с одним или несколькими локусами. Например, можно использовать гетерозиготы по хромосомам, одна из которых будет нести группу следующих друг за другом доминантных аллелей, а гомологичная ей - группу рецессивных аллелей тех же генов ABCDE /abcde. Если в хромосоме с доминантными генами произошла утрата отдельных генов, например DE, то у гетерозиготы ABC/abcde будут проявляться рецессивные признаки de. На этом принципе основан метод перекрывающихся делеции, используемый при построении цитологических карт!!!

21

Слайд 21

Цитогенетические карты хромосом составляются на основе дифференциальной окраски (темные и светлые полосы) и картирования генов в отдельных локусах хромосом.

22

Слайд 22

Цитогенетические карты дают информацию о расположении гена на хромосоме относительно ее участков, идентифицируемых методами дифференциального окрашивания. Благодаря такому окрашиванию хромосома в поле зрения микроскопа выглядит «поперечно исчерченной».

23

Слайд 23

Расположение окрашенных участков (бэндов) специфично для каждой хромосомы.

24

Слайд 24

Использование FISH-метода позволяет построить цитогенетические карты с разрешением 2-5 Мб, а его модификации для интерфазных хромосом - 0, 1 Мб. Таким образом, локализация картированного с помощью FISH-метода гена может быть установлена с точностью до субсегмента и локусабэнда.

25

Слайд 25

Картирование генов с помощью хромосомных мутаций Внутрихромосомные мутации – преобразование генетического материала в пределах одной хромосомы. Межхромосомные – перестройки, в результате которых две негомологичные хромосомы обмениваются своими участками. Хромосомные мутации – это изменения в структуре хромосом

26

Слайд 26

Инверсии Инверсии - хромосомные перестройки, связанные с поворотом отдельных участков хромосомы на 180°, были открыты А. Стёртевантом в 1926 г.

27

Слайд 27

Парацентрическая инверсия – происходят два разрыва хромосом, оба по одну сторону от центромеры. На участке между точками разрыва происходит поворот 180. Перицентрическая инверсия – точки разрывов расположены по обе стороны от центромеры.

28

Слайд 28

У особей, гетерозиготных по инверсии, в хромосомах образуется петля. У гомозиготных особей по инверсиям кроссинговер происходит без изменений.

29

Слайд 29

У гетерозиготных особей по парацентрической инверсии происходит «запирание» кроссинговера следующим образом: в случае перекреста между генами С и D образуются два продукта: ацентрические хромосомы и дицентрические хромосомы, т. е. без центромеры и с двумя центромерами соответственно. Обе комбинации летальны.

30

Слайд 30

Дицентрик образует «хромосомный мост» в анафазе 1 мейоза, который виден под микроскопом. Обе комбинации летальны. Таким образом, в результате кроссинговера образуются нежизнеспособные гаметы, и потомства нет.

31

Слайд 31

При перицентрической инверсии, в случае перекреста между генами С и Д, также получаются два продукта. Дупликация А и делеция F. Каждая из полученных хромосом несет дупликацию одного неинвертированного района хромосом и делецию другого. В результате такие гаметы нежизнеспособны и кроссоверы не выявляются. Так же как и парацентрические, перицентрические инверсии «запирают» кроссинговер. Поскольку кроссинговер в инвертированном участке хромосомы «заперт », в нем могут формироваться блоки мутаций, отличные от тех, которые локализованы в гомологичном фрагменте хромосомы, но не инвертированном. Это явление называют инверсионный полиморфизм популяций.

32

Слайд 32

Хромосомы с множественными инверсиями используют при создании балансеров, т. е. линий, позволяющих поддерживать летальные мутации и мутации по плодовитости. Один из примеров - линия С L В. Более надежными балансерами, т. е. содержащими несколько инверсий, являются линии Base, Binsn. Конструирование балансерных хромосом по существу представляет собой первый пример генетической инженерии. Другой пример балансеров - линия Су (загнутые крылья, летальность), в которой доминантная мутация сопряжена с длинной инверсией, захватывающей почти всю вторую хромосому. В потомстве от скрещивания гетерозигот по Су выживают только мухи родительских классов, т. е. линия сбалансирована, и исследуемая леталь /, постоянно в ней поддерживается в гетерозиготном состоянии.

33

Слайд 33

Использование делеций для локализации генов было названо методом делеционного картирования. Делеции Делеция – утрата участка хромосомы. Делеции были открыты в 1917 г. К. Бриджесом генетическими методами. В нормальной хромосоме гены расположены в определенном порядке: tABCDEF При потере фрагмента хромосомы возможны два принципиальных варианта: ABEF или ABC т. е. может быть потеряна средняя или концевая часть хромосомы.

34

Слайд 34

Транслокации Хромосомные перестройки, в результате которых часть хромосомы переноситься в другое место этой же хромосомы или на другую хромосому. Но общее число генов не меняется!!! Транслокации были открыты К. Бриджесом в 1923 г. у дрозофилы.

35

Слайд 35

Внутрихромосомные транслокации возникают в результате образования трех разрывов и перенесения хромосомного сегмента в другой район той же хромосомы. Межхромосомные реципрокные транслокации возникают в результате образования двух разрывов и обмена участками негомологичных хромосом.

36

Слайд 36

Две хромосомы в результате реципрокного обмена фрагментами образуют гетерозиготную транслокацию. Если образуются три разрыва и фрагмент хромосомы удаляется из одной хромосомы и встраивается в другую - это инсерционная транслокация.

37

Слайд 37

Самым ярким примером, когда с помощью транслокации был картирован ген, является миопатия Дюшенна. Ген миопатии Дюшенна локализован в X хромосоме и обычно проявляется тяжелой миопатией у мальчиков. Однако обнаружили несколько случаев типичной клинической картины миопатии у женщин. Они оказались связанными с транслокациями между хромосомой X и аутосомами, причем в хромосоме X разрыв всегда локализовался в районе Хр21.

38

Слайд 38

Картирование гена иногда может быть достигнуто за счет использования эффекта дозы гена. В случае делеции следует ожидать уменьшение на 50 % продукта гена (это прежде всего может быть фермент). Именно таким способом был картирован ген кислой фосфатазы эритроцитов в хромосоме 2.

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АЛЬ-ФАРАБИ

Факультет : биологии и биотехнологии

Кафедра : биотехнологии

«РЕФЕРАТ»

На тему: ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СЦЕПЛЕНИЕ И КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА.

Выполнили : студенты 3-курса (мед.бт.)

Нуралибеков С.Ш.

Давронова М.А.

Проверила : к.б.н. ,доцент кафедры молекулярной

биологии и генетики Омирбекова Н.Ж.

АЛМАТЫ 2018

Генетические карты сцепления…………………………………………………………..3

Современные методы построения генетических карт сцепления……..........……...….5

ПЦР в исследованиях генома человека………………………………....………….……8

Физические карты низкого разрешения…………………………………………..….….9

Физические карты высокого разрешения……………..………………………..………11

Список использованных источников ………………...……………..………………….13

Картирование и определение первичной структуры генома человека

После краткого рассмотрения основных методов, наиболее часто используемых в молекулярной генетике для исследования структуры и механизмов функционирования генов, представляется целесообразным на примере генома человека подробнее познакомиться с практическим применением этих методов и их модификаций для изучения больших геномов. В целях всестороннего исследования генома человека, этого колоссального по объему хранилища его генетической информации, недавно была разработана и воплощается в жизнь специальная международная программа "Геном человека" ("Human Genome Project"). Основной задачей программы является построение исчерпывающих генетических карт большого разрешения каждой из 24 хромосом человека, которое, в конечном счете, должно завершиться определением полной первичной структуры ДНК этих хромосом. В настоящее время работы по проекту идут полным ходом. В случае успешного его завершения (а это по планам должно произойти в 2003 г.) у человечества появятся перспективы досконального изучения функциональной значимости и механизмов функционирования каждого из его генов, а также генетических механизмов, управляющих биологией человека, и установления причин большинства патологических состояний его организма.

Основные подходы к картированию генома человека

Решение основной задачи программы "Геном человека" включает три основных этапа. На первом этапе необходимо специфическим образом разделить каждую индивидуальную хромосому на части меньшего размера, позволяющего их дальнейший анализ известными методами. Вторая стадия исследований предполагает определение взаимного расположения этих индивидуальных фрагментов ДНК друг относительно друга и их локализации в самих хромосомах. На завершающем этапе необходимо произвести собственно определение первичной структуры ДНК каждого из охарактеризованных фрагментов хромосом и составить полную непрерывную последовательность их нуклеотидов. Решение задачи не будет полным, если в найденных последовательностях нуклеотидов не удастся локализовать все гены организма и определить их функциональное значение. Прохождение трех вышеперечисленных этапов требуется не только для получения исчерпывающих характеристик генома человека, но и любого другого генома большого размера.

Генетические карты сцепления

Генетические карты сцепления представляют собой одномерные схемы взаимного расположения генетических маркеров на индивидуальных хромосомах. Под генетическими маркерами понимают любые наследуемые фенотипические признаки, различающиеся у отдельных особей. Фенотипические признаки, отвечающие требованиям генетических маркеров, весьма разнообразны. Они включают в себя как особенности поведения или предрасположенность к определенным заболеваниям, так и морфологические признаки целых организмов или их макромолекул, различающихся по структуре. С развитием простых и эффективных методов исследования биологических макромолекул такие признаки, известные под названием молекулярных маркеров, стали наиболее часто использоваться при построении генетических карт сцепления. Прежде чем перейти к рассмотрению методов построения таких карт и их значения для исследования генома, необходимо напомнить , что термин "сцепление" употребляется в генетике для обозначения вероятности совместной передачи двух признаков от одного из родителей потомству.

При образовании половых клеток (гамет) у животных и растений на стадии мейоза, как правило, происходит синапсис (конъюгация) гомологичных хромосом. Сестринские хроматиды гомологичных хромосом соединяются по всей длине друг с другом, и в результате кроссинговера (генетической рекомбинации между хроматидами) происходит обмен их частями. Чем дальше два генетических маркера располагаются друг от друга на хроматиде, тем больше вероятность того, что разрыв хроматиды, необходимый для кроссинговера, произойдет между ними, и два маркера в новой хромосоме, принадлежащей новой гамете, окажутся отделенными друг от друга, т.е. их сцепление нарушится. Единицей сцепления генетических маркеров является морганида (единица Моргана, М), которая содержит 100 сантиморганид (сМ). 1 сМ соответствует физическому расстоянию на генетической карте между двумя маркерами, рекомбинация между которыми происходит с частотой 1%. Выраженная в парах оснований 1 сМ соответствует 1 млн п.о. (м.п.о.) ДНК.

Генетические карты сцепления правильно отражают порядок расположения генетических маркеров на хромосомах, однако полученные при этом значения расстояний между ними не соответствуют реальным физическим расстояниям. Обычно данный факт связывают с тем, что эффективность рекомбинации между хроматидами на отдельных участках хромосом может сильно различаться. В частности, она подавлена в гетерохроматиновых участках хромосом. С другой стороны, в хромосомах часто встречаются "горячие точки" рекомбинации. Использование частот рекомбинации для построения физических генетических карт без учета этих факторов будет приводить к искажениям (соответственно занижению или завышению) реальных расстояний между генетическими маркерами. Таким образом, генетические карты сцепления являются наименее точными из всех имеющихся типов генетических карт, и их можно рассматривать только в качестве первого приближения к реальным физическим картам. Тем не менее, на практике именно они и только они позволяют локализовать сложные генетические маркеры (например ассоциированные с симптомами заболевания) на первых этапах исследования и дают возможность их дальнейшего изучения. Необходимо помнить, что в отсутствие кроссинговера все гены, находящиеся на индивидуальной хромосоме, передавались бы от родителей потомству вместе, поскольку они физически сцеплены друг с другом. Поэтому индивидуальные хромосомы образуют группы сцепления генов, и одной из первых задач построения генетических карт сцепления является отнесение исследуемого гена или последовательности нуклеотидов к конкретной группе сцепления. В след. таблице перечислены современные методы, которые, по данным В.А. МакКьюзика, наиболее часто использовались для построения генетических карт сцепления до конца 1990 г.

Современные методы построения генетических карт сцепления

Метод	Число картированных локусов
Гибридизация соматических клеток	1148
Гибридизация in situ	687
Семейный	466
Определение эффекта дозы	159
Рестрикционное картирование	176
Использование хромосомных аберраций	123
Использование синтении	110
Сегрегация генов, индуцированная облучением	18
Другие методы	143
Всего	3030

Гибридизация соматических клеток. Одним из наиболее популярных методов отнесения генетического маркера (функционально активного гена) к конкретной группе сцепления является гибридизация (слияние друг с другом) соматических клеток разных биологических видов организмов, один из которых – исследуемый. У межвидовых гибридов соматических клеток в процессе культивирования происходит утрата хромосом преимущественно одного из биологических видов. Потеря хромосом носит, как правило, случайный характер, и образующиеся клоны клеток содержат оставшиеся хромосомы в разных сочетаниях. Анализ клонов, содержащих разные наборы хромосом исследуемого вида, позволяет определить, с какой из этих оставшихся хромосом ассоциирована экспрессия исследуемого маркера, и, следовательно, локализовать ген на конкретной хромосоме.

Гибридизация in situ. Метод гибридизации in situ также широко используется для картирования последовательностей нуклеотидов на хромосомах. С этой целью препараты фиксированных хромосом гибридизуют (инкубируют при повышенной температуре с последующим охлаждением) с исследуемыми последовательностями нуклеотидов, меченными радиоактивной, флуоресцентной или иной меткой. После отмывания несвязавшейся метки оставшиеся меченые молекулы нуклеиновых кислот оказываются ассоциированными с участками хромосом, содержащими последовательности, комплементарные исследуемым меченым последовательностям нуклеотидов. Полученные гибриды анализируют с помощью микроскопа либо непосредственно, либо после авторадиографии. Для этой группы методов характерна более высокая разрешающая способность, чем для гибридизации соматических клеток, поскольку они позволяют локализовать изучаемые последовательности нуклеотидов на хромосомах. По мере выполнения программы "Геном человека" в руках исследователей появляется все больше изолированных последовательностей нуклеотидов, которые можно использовать в качестве зондов для гибридизации in situ. В связи с этим данные методы по частоте использования в последнее время прочно выходят на первое место. Наиболее популярной оказывается группа методов, получивших название флуоресцентной гибридизации in situ (fluorescence in situ hybridization – FISH), при проведении которой используются полинуклеотидные зонды, содержащие флуоресцентную метку. В частности, в 1996 г. было опубликовано >600 работ, в которых описано использование этого метода.

Семейный генетический анализ сцепления. Эта группа методов часто используется в медицинской генетике для выявления связи (сцепления) между симптомами заболевания, вызываемого мутацией в неизвестном гене, и другими генетическими маркерами. В данном случае в качестве одного из генетических маркеров выступают сами симптомы заболевания. В геноме человека обнаружено большое количество полиморфизмов, в том числе ПДРФ. ПДРФ распределены более или менее равномерно в геноме человека на расстоянии 5–10 сМ друг от друга. Чем ближе индивидуальные полиморфные локусы расположены к гену , ответственному за заболевание, тем меньше вероятность их разделения при рекомбинации в мейозе и тем чаще они будут встречаться вместе у больного индивидуума и вместе передаваться от родителей потомству. Клонировав протяженный участок генома, включающий соответствующий полиморфный маркер (его отбор из клонотеки геномной ДНК проводят с помощью зонда), можно одновременно вместе с ним с большой вероятностью выделить ген, вызывающий наследственное заболевание. Такие подходы были, в частности, успешно применены для проведения семейного анализа и выделения соответствующих генов при мышечной дистрофии Дюшенна, кистозном фиброзе почек (муковисцидозе) и миотонической дистрофии. Информативность отдельных ПДРФ генома человека зависит от уровня их гетерозиготности в исследуемой популяции. Мерой информативности ПДРФ как генетического маркера по предложению Д. Ботштейна и соавторов (1980 г.) принято считать значение содержания полиморфной информации PIC (polymorphism information content), которое представляет собой отношение числа скрещиваний, в которых хотя бы у одного из родителей исследуемый полиморфный маркер находится в гетерозиготном состоянии, ко всем скрещиваниям.

Определение эффекта дозы гена и использование хромосомных аберраций . Этими методами обнаруживают корреляции между уровнем экспрессии исследуемого гена и количеством конкретных хромосом в анеуплоидных линиях клеток или структурными перестройками хромосом (хромосомными мутациями – аберрациями). Анеуплоидией называют наличие у клетки, ткани или целого организма числа хромосом, не равного типичному для данного биологического вида. Хромосомные аберрации в виде транслокаций участков хромосом в гетерохроматиновые области тех же самых или других хромосом часто сопровождаются подавлением транскрипции генов, расположенных в транслоцированных участках или в хромосоме-акцепторе (мозаичный эффект положения).

Использование синтении. Синтения – это структурное сходство групп сцепления генов у организмов разных биологических видов. В частности, в геномах человека и мыши известно несколько десятков синтеничных групп генов. Наличие феномена синтении позволяет суживать круг поиска места локализации исследуемого гена на хромосомах, ограничивая его областью известных генов, принадлежащих к конкретной синтеничной группе.

Сегрегация генов, индуцируемая ионизирующим излучением. С помощью этого метода определяют расстояние между исследуемыми генами путем оценки вероятности их разделения (сегрегации) после облучения клеток определенной стандартной дозой ионизирующего излучения. Облученные клетки спасают от гибели гибридизацией с соматическими клетками грызунов, и у соматических гибридов в культуре определяют наличие исследуемых маркеров облученных клеток. В итоге удается сделать вывод о наличии или отсутствии сцепления (физическом расстоянии) между этими генами.

Среди других методов следует упомянуть способы, основанные на использовании для картирования генов больших фрагментов ДНК, образуемых под действием крупнощепящих рестриктаз. После расщепления геномной ДНК образующиеся фрагменты разделяют электрофорезом в импульсном электрическом поле и далее их гибридизуют по Саузерну с зондами, соответствующими картируемым генам. Если после проведения гибридизации сигналы обоих зондов локализуются на одном и том же крупном фрагменте ДНК, это говорит о тесном сцеплении таких генов.

ПЦР в исследованиях генома человека

Полимеразная цепная реакция занимает центральное место в разработке подходов к практическому осуществлению программы "Геном человека". Как уже обсуждалось выше, с помощью ПЦР можно быстро и эффективно амплифицировать почти любой короткий участок генома человека, и полученные продукты ПЦР далее использовать в качестве зондов для картирования соответствующих участков на хромосомах путем гибридизации по Саузерну или in situ.

Концепция STS. Одной из ключевых концепций , лежащих в основе картирования генов человека в рамках обсуждаемой программы, является концепция сайтов, привязанных к последовательностям (sequence-tagged sites – STS). В соответствии с этой концепцией все фрагменты ДНК, используемые для построения генетических или физических карт, можно однозначно идентифицировать с помощью последовательности нуклеотидов длиной в 200–500 п.о., которая будет уникальной для данного фрагмента. Каждый из этих сайтов необходимо секвенировать, что даст возможность в дальнейшем их амплифицировать с помощью ПЦР и применять в качестве зондов. Использование STS позволило бы применять их последовательности в виде продуктов ПЦР в качестве зондов для направленного выделения любого фрагмента ДНК того или иного участка генома из клонотек геномных последовательностей. В результате могут быть созданы базы данных, включающие локализацию и структуру всех STS, а также праймеров, необходимых для их амплификации. Это избавило бы лаборатории от необходимости хранения многочисленных клонов и их рассылки в другие лаборатории для проведения исследований. Кроме того, STS создают основу для разработки единого языка, на котором разные лаборатории могли бы описывать свои клоны. Таким образом, конечным результатом разработки концепции STS была бы исчерпывающая карта STS генома человека. Теоретически для построения генетической карты размером в 1 сМ необходимо 3000 полностью информативных, полиморфных ДНК-маркеров. Однако поскольку полиморфные маркеры распределены в геноме неравномерно и лишь немногие из них полностью информативны, реальное число маркеров, требуемых для построения карты такого размера, оценивается в 30–50 тысяч. Для получения маркеров, соответствующих исследуемым участкам хромосом, в настоящее время часто применяют праймеры, соответствующие диспергированным повторяющимся последовательностям, среди которых первыми стали использовать Alu-последовательности.

Alu-ПЦР. Диспергированные повторяющиеся Alu-последовательности характерны именно для генома человека. Праймеры, специфичные в отношении Alu-последовательностей, используют для амплификации участков ДНК генома человека, заключенных между Alu-повторами, которые располагаются в среднем на расстоянии 4–10 т.п.о. друг от друга. Другим вариантом Alu-ПЦР является направленный синтез с ее помощью ДНК-зондов к участкам хромосом, полученным после лазерной фрагментации, индивидуальным хромосомам, выделенным с помощью проточной цитофлуориметрии, или ДНК гибридных клеток, содержащих определенную часть генома человека. Кроме того, Alu-ПЦР используют для получения уникальных фингерпринтов , характеризующих клеточные гибриды с точки зрения стабильности их генома, а также для характеристики фрагментов ДНК человека, клонированных в YAC-векторах, космидах или векторах на основе ДНК бактериофагов. Уникальность Alu-последовательностей для генома человека делает возможным их применение для "прогулок по хромосомам" , а также для расширения существующих контигов. Поскольку в геноме человека >90% умеренно повторяющихся последовательностей представлены семействами Alu и KpnI, неудивительно, что последние также применяются в ПЦР для тех же целей, что и Alu. Однако здесь профили продуктов ПЦР менее сложны, поскольку последовательности KpnI повторяются в геноме реже и обладают характерной локализацией в хромосомах.

ПЦР активно используется для выявления полиморфных молекулярных маркеров при построении генетических карт сцепления, основные принципы получения которых были рассмотрены выше. Этот метод оказывается полезным и при секвенировании ДНК, а также при построении физических карт высокого разрешения для генома человека. О последних двух сферах применения ПЦР подробнее речь пойдет ниже.

Физические карты низкого разрешения

В отличие от рассмотренных выше генетических карт сцепления физические карты генома отражают реальное расстояние между маркерами, выражаемое в парах оснований. Физические карты различаются по степени их разрешения, т.е. по тем деталям структуры генома, которые на них представлены. Исчерпывающая физическая карта генома человека максимального разрешения будет содержать полную нуклеотидную последовательность всех его хромосом. На другом полюсе физических карт с минимальным разрешением находятся хромосомные (цитогенетические) карты генома.

Четыре типа генетических карт геномной ДНК и их взаимоотношения

1 – генетическая карта сцепления, 2 – физическая рестрикционная карта, пробелы обозначают места расщепления ДНК рестриктазами, 3 – физическая карта контигов, показаны перекрывающиеся клоны ДНК, полученные с помощью YAC-векторов, 4 – исчерпывающая физическая карта в виде последовательности нуклеотидов ДНК. На всех картах представлен один и тот же участок хромосомы

Хромосомные карты. Хромосомные карты генома человека получают локализацией генетических маркеров на индивидуальных хромосомах с использованием цитогенетических методов, включая авторадиографию и FISH. В последних двух случаях радиоактивная или флуоресцентная метки, ассоциированные с исследуемыми генетическими локусами интактных хромосом, выявляются с помощью световой микроскопии. Еще совсем недавно хромосомные карты позволяли локализовать исследуемый фрагмент ДНК на участке хромосомы протяженностью 10 м.п.о. Современные методы гибридизации in situ с использованием метафазных хромосом , главным образом, метод FISH, локализуют полинуклеотидные маркеры в пределах 2–5 м.п.о. Более того, при гибридизации in situ с интерфазными хромосомами, в которых генетический материал находится в менее компактной форме, разрешающая способность хромосомных карт приближается к 100 т.п.о.

Точность хромосомных карт повышается и с использованием современных генетических методов. Например, способность ПЦР амплифицировать сегменты ДНК единичного сперматозоида позволяет исследовать большое число мейозов, как бы законсервированных в отдельных образцах спермы. В результате появляется возможность проверки взаимного расположения генетических маркеров, локализованных на хромосомных картах более грубыми методами.

Карты кДНК . Карты кДНК отражают положение экспрессирующихся участков ДНК (экзонов) относительно известных цитогенетических маркеров (бэндов) на метафазных хромосомах. Поскольку такие карты дают представление о локализации транскрибирующихся участков генома, в том числе и генов с неизвестными функциями, они могут быть использованы для поиска новых генов. Этот подход особенно полезен при поиске генов, повреждения которых вызывают заболевания человека, в том случае если приблизительная локализация таких участков хромосом уже предварительно проведена на генетических картах сцепления в результате семейного генетического анализа.

Физические карты высокого разрешения

Две стратегии построения физических карт ДНК

а – стратегия "сверху вниз": ДНК целой хромосомы расщепляется крупнощепящими рестриктазами, для каждого из индивидуальных фрагментов ДНК строится рестрикционная карта; б – стратегия "снизу вверх", индивидуальные YAC-клоны после идентификации объединяются в контиги

В попытках построения карт генома человека высокого разрешения экспериментально реализуются два альтернативных подхода, получивших названия картирования сверху вниз (top-down mapping) и картирования снизу вверх (bottom-up mapping). При картировании сверху вниз исходным в анализе является препарат ДНК индивидуальной хромосомы человека. ДНК разрезается крупнощепящими рестриктазами (например NotI) на длинные фрагменты, которые после разделения электрофорезом в импульсном электрическом поле подвергаются дальнейшему рестрикционному анализу с другими рестриктазами. В результате получают макрорестрикционную карту, на которой достаточно полно представлены все последовательности исследуемой хромосомы или ее части, однако ее разрешение невысоко. На такой карте очень трудно локализовать индивидуальные гены. К тому же каждая индивидуальная карта редко охватывает протяженные сегменты ДНК (как правило, не более 1–10 м.п.о.).

При картировании генома человека снизу вверх на основе препарата суммарной ДНК генома или индивидуальной хромосомы получают серию случайных клонов протяженных последовательностей ДНК (10–1000 т.п.о), часть из которых перекрывается друг с другом. В качестве вектора для клонирования в этом случае часто используют искусственные минихромосомы бактерий (BAC) или дрожжей (YAC), подробно описанные в разделе 7.2.4. Серия частично перекрывающихся и дополняющих друг друга клонов образует непрерывную состыкованную (contiguous) последовательность нуклеотидов ДНК, получившую название контига (contig). Правильность полученных контигов подтверждают гибридизацией in situ (FISH) с одновременной их привязкой к определенным участкам исследуемых хромосом. Карты, основанные на контигах, представляют полную информацию о структуре отдельных сегментов хромосом и позволяют локализовать отдельные гены. Однако такие карты трудно применять для реконструкции целых хромосом или протяженных их участков из-за отсутствия соответствующих клонов в имеющихся клонотеках генов.

Основная проблема, которую приходится решать при использовании обоих подходов к построению физических карт высокого разрешения, – объединение разрозненных фрагментов ДНК в непрерывные последовательности нуклеотидов. Чаще всего для этого применяют специальные клонированные фрагменты ДНК, получившие название связующих (linking) клонов. Фрагменты ДНК из связующих клонов содержат в своих внутренних частях последовательности нуклеотидов крупнощепящих рестриктаз и, следовательно, представляют собой места стыковки фрагментов ДНК , используемых на первых этапах физического картирования. Гибридизацией по Саузерну, при проведении которой в качестве зондов используют фрагменты ДНК связующих клонов, определяют фрагменты ДНК физических карт, содержащие последовательности нуклеотидов окрестностей сайтов рестрикции крупнощепящих рестриктаз. Если два таких фрагмента найдены, то соответствующий связующий клон перекрывает оба этих фрагмента и является их частью. Связующие клоны, в свою очередь, отбирают из клонотек генов с помощью зондов, которые представляют собой последовательности нуклеотидов сайтов рестрикции крупнощепящих рестриктаз.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1) Clark M.S. Comparative genomics: The key to understanding the Human Genome Project // BioEssays. 1999. Vol. 21. P. 21–30.

2) Billings P.R., Smith C.L., Cantor C.L. New techniques for physical mapping of the human genome // FASEB J. 1991. Vol. 5. P. 28–34.

3) Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989. 254 с.

4) http://referatwork.ru/refs/source/ref-8543.html

Slide 1

Выполнила: Голубева Ю.В. 410гр

Slide 2

Одна из основных задач современной генетики
заключается в выяснении природы комплексных
признаков, к которым в частности относятся
многие распространенные болезни человека и
характеристики продуктивности
сельскохозяйственных животных. Стартовым
этапом на пути решения этого вопроса
является

Slide 3

Картирование генов -

Slide 4

Стратегические подходы
к картированию геномов

Slide 5

Стратегия прямой
генетики

Различия во времени появления,
необходимой методической базой и
спектре возможностей. Функция гена
известна хотя бы частично.

Slide 6

Функциональное
картирование
 Основа - наличие некоторой информации о
биохимическом полиморфизме, лежащем в
основе того или иного наследственного
признака.
 начинается с выделения в чистом виде
белкового продукта гена.
 к нему по аминокислотной последовательности
подбирают вырожденные праймеры

 проводят ПЦР-скрининг

Slide 7

Большинство генов, функция которых
была известна, уже клонированы и
локализованы.

Slide 8

Для большинства генов, которые
были локализованы, характерны
структурные аномалии (как
правило, это гены, ответственные за
наследственные заболевания
человека), что существенно
облегчает заключительную стадию
поиска гена - выделение и
локализацию гена.

Slide 9

Кандидатное
картирование
информация о функциональном
изменении недостаточно полна, чтобы
точно указать ген
Информации достаточна для того,
чтобы выдвинуть предположения о
возможных кандидатах либо по их
функции, либо по положению на
хромосоме

Slide 10

Общее:
при функциональном, и при
кандидатном подходе клонирование
гена, как правило, предшествует его
точной локализации в геноме

локализовать ген означает пройти путь
от его функции к локализации на
хромосоме (позиции)

Slide 11

Стратегия обратной
генетики

От хромосомной карты к функции
гена. Возникло благодаря появление в
конце 80-х годов множества
высокополиморфных ДНК-маркеров

Slide 12

Позиционное
картирование
локализация гена при отсутствии всякой
функциональной информации о нем
место гена на карте устанавливают по
результатам анализа его сцепления с
ранее локализованными генетическими
маркерами, далее исследуется уже
область генома рядом с маркером

Slide 13

Генетический маркёр
(genetic marker)
Ген, детерминирующий
отчетливо выраженный
фенотипический признак,
используемый для
генетического картирования
и индивидуальной
идентификации организмов
или клеток. Также в качестве
генетических маркеров
могут служить целые
(маркерные) хромосомы.

Slide 14

Минусы
ограничением позиционного
подхода является низкая
разрешающая способность
генетических карт - интервал между
двумя соседними маркерами, в
котором локализован ген, может
оказаться слишком велик и
недоступен физическому
картированию.

Slide 15

Картирование генов –
виды
Физическое картирование
Генетическое картирование
Цитогенетическое(цитологическое)
картирование

Slide 16

Физическое
картирование
обширная группа методов, позволяющая строить
карты генома (обычно их называют физическими)
высокого уровня разрешения и определять
расстояния между локализуемыми нуклеотидными
последовательностями с точностью от нескольких
десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары.

Пример: картирование
генов с помощью
хромосомных мутаций

Slide 17

Типы физического
картирования
рестрикционное картирование
RH-картирование
клонирование в YAC (от англ. yeast artificial
chromosome)
BAC (от англ. bacterial artificial
chromosome) в космидах, плазмидах и
других векторах и контиг-картирование на
их основе
секвенирование ДНК

Slide 18

В том случае, когда известна
последовательность ДНК интересующего
локуса, эту последовательность можно
использовать для гибридизации с
хромосомами in situ, и место гибридизации
будет однозначно указывать на локализацию
локуса в определенном районе определенной
же хромосомы

Slide 19

Генетическое
картирование
картирование, основанное
на методах классической
генетики - определении
групп сцепления, частоты
рекомбинации и
построении генетических
карт, где единицей
измерения служат
проценты рекомбинации

Slide 20

Первый ген человека
был локализован на
Х-хромосоме в 1911
г.

Первый аутосомный
ген - только в 1968 г

Slide 21

Генетическая карта
(genetic map
Схема взаимного
расположения генов на
хромосоме (в группе
сцепления) и их
распределения по
разным хромосомам,
как правило,
включающая данные об
относительном
удалении генов друг от
друга (генетические
расстояния).

Slide 22

Генетическая карта
американской норки
включает 127 генов
(черный текст) и 39
микросателлитных
последовательностей
(красным текст).
Разным цветом
выделены районы
хромосом норки
гомологичные
хромосомным.

Slide 23

Преимущества
большое число консервативных групп
сцепления
создание банков клеточных культур
для локализации вновь возникшей
мутации к настоящему моменту есть
набор маркерных генов для каждой
хромосомы.

Slide 24

Построение
генетической карты
Шаг 1: формирование групп
сцепления генов и исследование их
взаимного расположения(Скрещивания
проводятся до тех пор, пока не удастся выявить
сцепленное наследование анализируемой
мутации с маркерными мутациями какой-либо
хромосомы)

Шаг 2: подсчитывание расстояния
между исследуемым геном и уже
известными маркерными генами

Slide 25

Единицы измерения
Генетическое расстояние между линейно
расположенными генами, выраженно в процентах
рекомбинации -

Два гена на хромосоме
находятся на расстоянии 1
сМ, если вероятность
рекомбинации между ними
в процессе мейоза
составляет 1%.

Классический пример Моргана –
расстояния между генами
дрозофилы

Slide 26

4 степени надежности
локализации данного гена
подтвержденная (установлена в двух и
более независимых лабораториях или на
материале двух и более независимых тестобъектов),
предварительная (1 лаборатория или 1
анализируемая семья),
противоречивая (несовпадение данных
разных исследователей),
сомнительная (не уточненные
окончательно данные одной лаборатории)

Slide 27

Минусы:
частота рекомбинации в
разных точках генома
различна, и расстояние
может существенно
варьировать

Необходим
тщательный
анализ
родословной
(если
картируется ген
заболевания)

в результате карты
сцеплений не отражают
реальных физических
расстояний между
маркерами и генами
на хромосомах.

Slide 28

Цитогенетическое
картирование
осуществляется с применением
методов цитогенетики, когда для
локализации каких-либо
нуклеотидных
последовательностей и
определения их взаимного
расположения используются
цитологические препараты

Slide 29

Цитологические карты
Метод цитологических карт основан на
использовании хромосомных перестроек –
перекрывающихся делеций.

При облучении и действии других
мутагенов в хромосомах часто
наблюдаются потери (делеции)
или вставки (дупликации)
небольших фрагментов,
сравнимых по величине с одним
или несколькими локусами.

Slide 30

Принципы:
Используются гетерозиготы по хромосомам, одна из которых
будет нести группу следующих друг за другом доминантных
аллелей, а гомологичная ей - группу рецессивных аллелей тех же
генов.
Если в хромосоме с доминантными генами произошла утрата
отдельных генов, например DE, то у гетерозиготы ABC/abcde будут
проявляться рецессивные признаки de. На этом принципе основан
метод перекрывающихся делеции, используемый при построении
цитологических карт.

Slide 31

Методы
дифференциального
окрашивания позволяют
идентифицировать на
препарате как отдельную
хромосому, так и любой
участок хромосомы

Разработанный на дрозофиле
специальный метод
перекрывающихся делеций был
использован для
цитологического картирования
генов у представителей многих
видов.

Slide 32

Хромосомные комплексы китайского хомячка
(А), мыши (Б) и их соматического гибрида (В)

Slide 33

Сравнение генетических и
цитологических карт хромосом
показывает их соответствие:
чем больший процент
кроссинговера разделяет пару
генов, тем больше и физическое
расстояние между ними.

Slide 34

Запись локализации
гена
Согласно официально утвержденной номенклатуре
(ISCN,1978), каждая хромосома человека после
дифференциальной окраски может быть разделена на
, нумерация которых начинается от
центромеры вверх (
), либо вниз
).
в каждом
участке тоже нумеруются в аналогичном порядке. Крупные
полосы разделяются на более мелкие

Slide 35

Slide 36

Алгоритм решения
задач на картирование
генов

Slide 37

Пример:
Составьте карту хромосомы,
содержащую гены, если
частота кроссинговера между
генами и равна 2,5%, и -
3,7%, и -6%, и - 2,8%, и -
6,2%, и - 15%, и - 8,8%

Slide 38

Slide 39

Используемая
литература
Э. Р. Рахманалиев, Е. А. Климов, Г. Е. Сулимова МЕТОДЫ
КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
КАРТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАДИАЦИОННЫХ
ГИБРИДОВ (RH КАРТИРОВАНИЕ)
Аксенович Т.И. Проблемы картирования QTL (Институт
цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск)
Мяндлина Г.И. Молекулярные основы медицинской
генетики(кафедра биологии и общей генетики,
медицинского факультета РУДН)
В.И. Иванов Генетика Учебник для вузов, 2006

Генетические карты хромосом - это схема взаимного расположения и относительных расстояний между генами определенныххромосом, находящихся в одной группе сцепления.

Впервые в 1913 - 1915 годах на возможность построения генетических карт хромосом указывают Т. Морган и его сотрудники. Они экспериментально показали, что основываясь на явлениях сцепления генов и кроссинговера можно построить генетические карты хромосом . Возможность картирования основана на постоянстве процента кроссинговера между определенными генами. Генетические карты хромосом составлены для многих видов организмов: насекомых (дрозофила, комар, таракан и др.), грибов (дрожжи, аспергилл), для бактерий и вирусов.

Генетические карты человека используются в медицине при диагностике ряда тяжелых наследственных заболеваний человека. В исследованиях эволюционного процесса сравнивают генетические карты разных видов живых организмов. Помимо генетических, существуют и другие карты хромосом.

Физическая карта – графическое представление порядка следования физических маркеров (фрагментов молекулы ДНК), расстояние между которыми определяется в парах нуклеотидов.

Рестрикционная карта – вид физической карты, на которой указан порядок следования и расстояния между сайтами расщепления ДНК рестриктазами (обычно участок узнавания рестриктазы 4-6 п.н.). Маркерами этой карты являются рестрикционные фрагменты/сайты рестрикции.

Картирование хромосом- Определение положения данного гена на какой-либо хромосоме относительно других генов. Используют три основные группы методов картирования генов – физическое (определение с помощью рестрикционных карт, электронной микроскопии и некоторых вариантов электрофореза межгенных расстояний – в нуклеотидах), генетическое (определение частот рекомбинаций между генами, в частности, в семейном анализе и др.) и цитогенетическое (гибридизации in situ, получение монохромосомных клеточных гибридов, делеционный метод и др.). В генетике человека приняты 4 степени надежности локализации данного гена – подтвержденная (установлена в двух и более независимых лабораториях или на материале двух и более независимых тест-объектов), предварительная (1 лаборатория или 1 анализируемая семья), противоречивая (несовпадение данных разных исследователей), сомнительная (не уточненные окончательно данные одной лаборатории).

На сегодняшний день не существует четкой классификации методов картирования. Так, например, одни авторы относят цитогенетические методы (FISH, PRINS и т.п.) к генетическим методам, другие к физическим. Однако, следует помнить, что по сути все методы являются генетическими, так как конечный результат картирования - получение максимально подробной карты взаимного расположения структурных, функциональных и полиморфных последовательностей генома и определение расстояний между ними. Поэтому разделение методов картирования на генетические, цитогенетические и физические, предложенное в этой статье, основано исключительно на методических подходах, используемых для построения генетических карт.

Генетическое картирование - это картирование, основанное на методах классической генетики - определении групп сцепления, частоты рекомбинации и построении генетических карт, где единицей измерения служат проценты рекомбинации, или сантиморганы (сМ). Цитогенетическое картированиефизическое картирование - это обширная группа методов, позволяющая строить карты генома (обычно их называют физическими) высокого уровня разрешения и определять расстояния между локализуемыми нуклеотидными последовательностями с точностью от нескольких десятков тысяч п.н. до одной нуклеотидной пары. осуществляется с применением методов цитогенетики, когда для локализации каких-либо нуклеотидных последовательностей и определения их взаимного расположения используются цитологические препараты. И, наконец,

Стратегические подходы к картированию геномов

В настоящее время выделяют три основных подхода к картированию геномов, различающихся временем появления, необходимой методической базой и спектром возможностей: функциональный, кандидатный и позиционный (рис. 1).

Рис. 1.

Вплоть до последнего времени в картировании доминировал функциональный подход, основанный на априорном наличии некоторой информации о биохимическом полиморфизме, лежащем в основе того или иного наследственного признака. Методически такое картирование начинается с выделения в чистом виде белкового продукта гена. Далее к нему по аминокислотной последовательности подбирают вырожденные праймеры и проводят ПЦР-скрининг геномных библиотек. Однако список генов, для которых эта информация была достаточно полной к настоящему времени практически исчерпан и большинство генов, функция которых была известна, уже клонированы и локализованы.

Близко к функциональному и кандидатное картирование. В этом случае информация о функциональном изменении недостаточно полна, чтобы точно указать ген, однако достаточна для того, чтобы выдвинуть более или менее обоснованные предположения о возможных кандидатах либо по их функции, либо по положению на хромосоме. Важно подчеркнуть, что и при функциональном, и при кандидатном подходе клонирование гена, как правило, предшествует его точной локализации в геноме, т.е. картированию. В рамках этих подходов локализовать ген означало пройти путь от его функции к локализации на хромосоме (позиции). Такой путь принято считать выражением стратегии "прямой генетики", он характерен и для традиционных методов генетического и цитогенетического картирования. До недавнего времени другой путь был практически невозможен.

Появление в конце 80-х годов множества высокополиморфных ДНК-маркеров дало возможность пойти в обратном направлении - от хромосомной карты к функции. Стратегия "обратной генетики", применительно к поиску генов, получила воплощение в позиционном картировании, которое подразумевает локализацию гена при отсутствии всякой функциональной информации о нем. При этом его место на карте устанавливают по результатам анализа сцепления гена с ранее локализоваными генетическими маркерами и далее детально исследуется уже область генома рядом с маркером.

Главным ограничением позиционного подхода является низкая разрешающая способность генетических карт - интервал между двумя соседними маркерами, в котором локализован ген, может оказаться слишком велик и недоступен физическому картированию.

Для большинства генов, которые были локализованы, характерны структурные аномалии (как правило, это гены, ответственные за наследственные заболевания человека), что существенно облегчает заключительную стадию поиска гена - выделение и локализацию гена.

Способом, который позволяет преодолеть ограничения позиционного картирования, является объединение стратегии "обратной генетики" с преимуществами кандидатного подхода. Такой способ картирования, называемый позиционно-кандидатным, постепенно приходит на смену позиционному и заключается в поиске на выявленном участке генома подходящих кандидатных генов.

Похожая информация.